بیماریهای قابل انتقال بین انسان و حیوان (زئونوزها) (۳)

پروتئین‌های غشای خارجی (OMPs) بروسلا:

برخی ویژگی‌های پروتئین‌های غشای خارجی (OMPs) بروسلا کاملاً متمایز بوده و نقش مهمی را در تعیین خصوصیات بروسلاها ایفا می‌نمایند. OMPs بروسلا برطبق اندازه‌ی‌ آنها گروه‌بــندی مــی‌شوند. پروتئیـن‌های بـا جـرم مولکولی36تا38 کیــلودالتــون (38KDα-36)به‌عنوان پروتئیـن‌های پوریـن گروه2 و OMPs با جرم مـولکولی 34KDα-36 و 27-25KDα به‌عنوان پروتئین‌های گروه3 طبقه‌بندی شده‌اند. پروتئین‌های25ـ 31ـ و 36ـ کیلودالتون OMPs اصلی بوده درحالی‌که مولکول‌های10ـ 16ـ 19ـ 89 کیلو‌دالتون از ترکیبات فرعی هستند.

opm با جرم مولکولی36‌ـ کیلودالتون یک پورین بوده و opm با جرم مولکولی 25ـ کیلودالتون برای حفظ عفونت بروسلا ملی تنسیس بسیار قابل‌اهمیت شناخته شده‌است. لازم به ذکر است که سیـــستم دوجزئی BvrR/BvrS در کنترل تهاجم بروسلا به سلول‌های میزبان و بقای داخل سلولی آن ضروری شناخته شده است. سیستم BvrR/BvrS  به‌طور اختصاصی تجلی 2گروه از 3 گروه پورین غشای خارجی بروسلا را تنظیم می‌نماید. موتانت‌های بدون اثر BvrR/BvrS فاقد opm 25 تغییراتی را در آب گریزی، نفوذپذیری وحساسیت پوشش سلولی به پپتیدهای باکتری‌ اسید مورد‌نظر نشان داده که به تخفیف زهرآگینی (حدت) موتانت‌ها منجر خواهد شد.

opm با جرم‌ مولکولی 16کیلو‌دالتون شباهت زیادی به لیپوپروتئین‌های مرتبط به پپتیدوگلیکان باکتری‌های گرم منفی نشان داده و همانند opms با جرم مولکولی10ـ و 19ـ کیلو دالتونی، لیپوپروتئین‌های سطحی داری پیوند کووالانسی با اسیدهای چرب می‌باشند. این پروتئین‌ها در شش‌گونه اصلی و بایووارهای مرتبط با آنها وجود دارد. omp10 و omp19 دارای اجزا آنتی‌ژنی مشترک با باکتری‌های خانواده ریز‌وبیاسه(Rhizobiaceae) می‌باشند. حذف ژن‌های omp10 و omp19 به موتانت تخفیف حدت یافته منجر می‌شود. موتانت‌های omp10 کاهش مدت زمان بقا در موش و رشد ناقص درمحیط نشان داده درحالی‌که موتانت‌های omp19 حساسیت زیاد به پلی میکسینB و دئوکسی کولات سدیم داشته و پرگنه‌های بسیار کمتری ازکشت طحال موش پس‌از 4تا8 هفته عفونت تولید می‌نمایند. کلوکرت و همکاران این پروتئین‌ها را مورد بررسی وسیع‌تری قرارداده‌اند.

چندین ژن omp بروسلا شناسایی و مورد بررسی قرارگرفته‌اند. ژن omp3‌‌α پروتئین 25‌کیلودالتونی (omp25KD‌‌α) پیش‌تر شناخته شده را رمزدار (کد) کرده و ژن omp3b به omp31 بروسلا ملی‌تنسیس منتسب می‌باشد. با شناسایی ترادف ژن omp31، قطعه DNA به‌وسیله‌ی روش PCR تکثیر‌شده و پلی‌مورفیسم درجایگاه omp31 گونه‌های بروسلا نشان داده شد. بعداً این پلی‌مورفیسم برای تمایز بیـن گــونه‌های بــروسلا بــه وسیله روشPCR-RFLP و هیبریدیزاسیون DNA-DNA مورد استفاده قرارگرفت. بااستفاده از این رویکرد فقدان ژن در بروسلا آبورتوس به علت حذف 10کیلوباز (10kb) مشهود بوده، در‌حالی‌که تشخیص افتراقی و تمایز بروسلا نئوتومه از بایووارهای 4،3،1و5 بروسلا سوئیس امکان‌پذیر نبوده است.

تجزیه پورین پروتئین‌ 36‌کیلو‌ دالتون (36KD‌α) دو ژن omp2α و omp2b را آشکار ساخته،  که در کروموزوم به‌صورت تکرار کپی ژن تاحدود 85٪ ظاهر می‌گردد. این پلی مورفیسم ممکن‌است با حساسیت افتراقی رنگ وابسته بوده، که به عنوان یکی از آزمایش‌های بایوتای پینگ متداول مورد استفاده می‌باشد. شاخص‌هایRFLP دراین ژن‌ها امکان تمایز بین گونه‌های بروسلا و طبقه‌بندی اکثر بایووارهای درون گونه‌ها را فراهم می‌سازد. استفاده وسیع‌ترRFLP برای طبقه‌بندی گونه‌های بروسلا بر‌اساس ژن‌های omp25 و omp36 پیشنهاد شده‌است.

 ژنوم بروسلا:

خصوصیات ژنوم از اهمیت اساسی در تعریف جنس برخوردار است. از‌این‌رو ارتباط بروسلا با گروه a‌-2 پروتئوباکتر از‌طریق دو کروموزوم، همانند دیگر اعضای گروه مورد حمایت می‌باشد.

ژنوم بایووار I بروسلا ملی‌تنسیس تیپ سویه 16m برای اولین بار به‌وسیله‌ی دل وچیو وهمکاران به‌عنوان نامزد (کاندیدا) پروتفر و تایپ گونه‌های بروسلا درسال2002 مشخص گردید. بعداً ژنوم سویه رفرانس‌1330 بروسلا سوئیس و سویه فیلد941ـ9 بروسلا آبورتوس و اخیراً تیپ ATCC25840 بروسلا اوویس شناسایی شد. درمراحل بعدی نیز ژنوم دیگر سویه‌ها ازجمله سویه ‌2308 بروسلا آبورتوس باکاربرد وسیع در بررسی‌های تجربی و سویه واکسن S.19 بروسلا آبورتوس شناسایی‌شده و تاکنون‌13‌ژنوم بروسلاها مشخص گردیده است. این پیشرفت‌ها به درک و شناخت بیشتر گونه‌ها و بایووارهای بروسلا برای طبقه‌بندی و روابط فیلوژنیک احتمالی آنها بانیای اصلی منجر شده است.

ترکیب DNA بروسلاها نشان داده که تمامی اعضای جنس درمیزان پایه‌یی 55 تا58٪ گوانین+‌سیتوزین در‌بین شش‌گونه برخوردار بوده هرچند که بروسلا اوویس فاقد بخش‌کوچکی از ترادف پلی نوکلئوتید موجود در DNA دیگر گونه‌ها می‌باشد. لازم به ذکر است که بروسلاها ازامکان همانند سازی خارج کروموزومی چون پلاسمیدها یا فاژها با فقدان تولیداتی چون اگزوتوکسین و مقاومت قابل انتقال به آنتی‌بیوتیک‌ها برخوردار نیستند. در مقابل فاژهای لیز کننده آنها مشخص می‌باشند(جدول2). مهندسی مولکولی به توسعه چهار مشتق از حامل کلونی با دامنه‌ی وسیع میزبانی pBB RIMCS منجر شده که درگونه‌های بروسلا همانند سازی شده و قابل‌مقایسه با گروه‌ پلاسمیدهای IncQ, Inc P و Inc W و همچنین همانند سازی بنیادی col E1 و p15‌α می‌باشند.

وجود دو کروموزوم مستقل در تیپ سویه16M بروسلا ملی‌تنسیس با اندازه‌ تخمینی به‌ترتیب‌ 2/12‌ و ‌1/15 مگاباز در بررسی‌های اولیه الکتروفورز شناسایی شدند. در بررسی ژنوم وجود دو کروموزوم شامل کروموزوم I بزرگتر ازکروموزوم II با طول متوسط به ترتیب 2/1 و 1/2 مگاباز (Mb) دربین ژنوم موجود مورد تأیید قرارگرفت. بایووار‌3 بروسلا سوئیس دارای یک کروموزوم واحد منحصر به فرد به اندازه 1/3 ـ Mb می‌باشد. هر‌دو کروموزوم میزان سیتوزین + گوانین (C+G) مشابه با حد متوسط 57/1٪ برای کروموزوم I و57/3٪ برای کروموزومII دارند. کروموزوم I بروسلا اکثر فعالیت‌های متابولیکی هسته مرکزی چون رونوشت‌برداری، انتقال وسنتز پروتئین و همچنین پروتئین‌های وابسته به فاژ را رمز‌دار می‌کند. در‌مقابل، کروموزوم II ژن‌های درگیر درفرآیندهایی چون انتقال غشایی، تنظیم و متابولیسم انرژی راکد می‌کند. با‌وجودی‌که هیچ‌گونه منشا همانندسازی پلاسمید شناخته نشده، سویه1330 چریل‌ (Strain 1330 Chrill)  بروسلا سوئیس گروهی از ژن‌های همانندساز شبه پلاسمید از  جمله ژن RePc همانندساز پروتئین اولیه (BRA 001) وRep A پروتئین‌های تفکیکی و BRA1202) rep B و BRA 1203) مشابه با ژن‌های همانند ساز پلاسمید در پلاسمیدهای آگروباکتریوم Ti و پلاسمیدهای دیگر باکتری‌ها چون گونه‌های ریزوبیوم را نشان داده است.

اختلافات ژنی گونه‌ها در روش‌های‌MLVA و‌MLSA نشان‌داده شده لیکن بررسی‌های بیشتری مورد نیاز می‌باشد. درجدول۲ ویژگی‌های ژنی درمقایسه با بروسلا ملی‌تنسیس نشان داده شده‌است. سنتز پلی‌ساکاراید در گونه‌های بروسلا شناخته نشده اما در برخی باکتری‌های‌ متعلق به گروه آلفاـ2 پروتئوباکتریا شناسایی شده است. ژن 9-kb کد‌کننده ‌Cgs در زهرآگینی باکتری‌های بروسلا دخالت دارد.

عامل همانندساز IS711 برای اولین بار در بروسلا اوویس و بعد در تمامی شش‌گونه‌ی اصلی و اخیراً در بروسلاهای دریایی شناسایی شد. در بررسی ‌PCR  براساس پلی‌مورفیسم ترادف IS711  امکان شناسایی بایووارهای2،1 و4 بروسلا آبورتوس، 3 سرووار بروسلا ملی‌تنسیس، بروسلا اوویس و بایووار I بروسلا سوئیس فراهم آمده است.

سیر تکاملی (فیلوژنی)‌بروسلا:

بررسی‌های هیبریدیزاسیونDNA-DNA سویه‌های بروسلا را در فوق تیره اسید ریبونوکلئیک ریبوزومی IV قرار داده، که شامل گروه‌های آکروباکتریوم، ریزوبیوم، مایکوپلانا، فیلوباکتریوم و گروه Vd مرکز کنترل بیماریها (CDC) می‌باشد. جانشینی دسته‌ی پروتئوباکتریا با چهار زیرگروه آلفا تا دلتا دراین فوق تیره نیز پیشنهاد شده است.
بر مبنای همانندی 16s-rRNA و دیگر ترادف‌های DNA، بروسلا آبورتوس در گروه آلفا ـ2 از دسته پروتئوباکتریا قرارگرفته و باتوجه به بررسی‌های تجانس 16s-rRNA آکروباکتروم، تعلق بروسلا و فیلوباکتریوم به عنوان نزدیکترین جنس‌های مرتبط به اثبات رسیده‌است. با شناسایی و تعیین خصوصیات آکروباکتروم اینترمدیوم به‌عنوان گونه‌ی بینابینی ما‌بین آکروباکتروم و بروسلا نتیجه‌ی فوق بیشتر مورد حمایت قرارگرفت.

واتمن و همکاران درسال 2009 با بررسی 2246 گروه پروتئین درون ژنوم 10 سویه بروسلا به نمایندگی از بروسلا آبورتوس ب. ملی‌تنسیس، ب. سوئیس، ب. کنیس و ب.ستی و با استفاده از نزدیکترین وابسته‌ها در راسته ریزوبیال‌ها، آکروباکتروم (آکروباکتروم آنتروپی وآکروباکتروم اینترمدیوم)، بارتونلا کین‌تانا و مزوری زوبیوم لوتی (Mesorhizobium Loti) به‌عنوان گروه خارج از بروسلا، درجنس بروسلا شش دسته فیلوژنیک درون جنسی بروسلا آبورتوس، ب . ملی تنسیس، ب. سوئیس، ب. کنیس، ب. اوویس و ب. ستی شناسایی نمودند. آکروباکتروم نزدیکترین جنس خارج از گروه شناخته شد. نهایتاً منشاء مشترک دو گروه با نیای واحد تعیین گردید و وابستگی نزدیک بروسلا نئوتومه و بروسلا ستی شناخته شد.

در بررسی مقایسه‌ییSNP سیزده ژنوم بروسلا، بروسلا اوویس به‌عنوان گونه‌ی پایه‌یی و بروسلا ملی‌تنسیس و بروسلا آبورتوس در شاخه‌یی دورتر و با فاصله شناسایی گردید. این یافته موید آن است که بروسلای اولیه در ابتدا گوسفند را‌آلوده ساخته و بعد به خوک، گاو و بز انتقال یافته است. همانطوری که بررسی SNP نشان‌داده جنس به‌طور استثنایی تک شکلی (مونومورفیک) بوده و طی چند هزار سال تغییرات جزئی ایجاد شده است. با توجه به سیر تکاملی تیره سوئیده (Family suidea ـ تیره خوک سانان) در‌50 تا‌20 میلیون سال پیش و مقدم بر زیر راسته رومینانتیه (Ruminantiae ـ نشخوار کنندگان) شامل زیر تیره بوویده(sub-family Bovinae) و کاپرینه (sub-family Cappinae)، نتیجه‌ی فوق مورد بحث است. با وجود این به‌نظر نمی‌رسد قدمت میزبان ارتباطی داشته مگر این که وجود بروسلا پیش‌از ظهور نشخوارکنندگان نشان داده شود.
فاصله‌ی طبقه‌بندی بین بروسلا وآکروباکتروم با مقایسه ترادف‌های ژن recA و(rrs(16s-rRNA هفت‌مورد از 9 گونه‌ی آکروباکتریوم و 3 تیپ سویه پزودو آکروباکتریوم (pseud ochrobactrum) و همچنین 8‌گونه بروسلا (بروسلا اینوپیناتا هنوز توصیف نشده است) مورد بررسی قرارگرفته است. درمقایسه ترادف‌های rrs هفت سویه آکروباکتروم به‌عنوان هدف و با استفاده از آکروباکتروم آنتروپی (تیپ سویه) به مشابه سویه شاخص، فاصله بین گروه‌های زیر‌گونه‌یی درجنس با مقایسه تجزیهrec A تشکیل‌دهنده‌ی گروه متجانس شناسایی شد. ازطرفی دیگر،گونه‌های بروسلا ازآکروباکتروم اینترمدیوم ازطریق ردیف‌های (rrs (98/6٪) ,rec A (85/5٪ قابل تمایز نبوده‌اند. رابطه‌ی ‌نزدیک گونه‌های بروسلا با جنس آکروباکتروم (که ازنظر طبقه‌بندی چندگونه و زیر گونه متنوع را در برگرفته) به این نتیجه منجر‌شد که مؤلفان معیارهای بیشتری را برای مرزبندی روشن بین دوجنس ضروری دانستند. با جانشینی بروسلا اینوپینا تا در جنس بروسلا، توسعه ساختار طبقه‌بندی درست برطبق شاخص‌های رایج چون omp2 RFLP,16s-rRNA وMLST پیچیده‌تر شده و این‌گونه در خط مرزی بین بروسلا و آکروباکتریوم قرار گرفت.

رویکرد تازه‌ از طبقه‌بندی بر نقش بوم شناختی به‌عنوان فاکتور مهم در مرزبندی جنس‌ها و گونه‌ها اشاره دارد. ویژگی‌ ضروری بروسلا در نقش بیماریزایی آن در میزبان طبیعی با انواع غیر وابسته ازجمله انسان قراردارد. نقش زئونوتیک سه گونه‌ی اصلی بروسلا ملی‌تنسیس، بروسلا آبورتوس و بروسلا سوئیس و تاحد کمتری بروسلا کنیس به‌عنوان شاخص مهم مطرح می‌‌باشد. گونه‌های دیگر کمتر نقش زئونوتیک داشته هرچند که شواهدی در این ارتباط وجود دارد. در مقابل، جنس آکروباکتروم باکتری‌‌های محیطی با زندگی غیر بیماریزای آزاد بوده و تنها آکروباکتروم آنتروپی و آکروباکتروم اینترمدیوم با بیماری در انسان و معمولاً دربیمارانی با مشکلات دیگر مرتبط می‌باشند. بنابراین بیماریزایی ذاتی و فقدان حالت زندگی آزاد از ویژگی‌های متمایز جنس بروسلا محسوب می‌گردد.